Secuenciación del ADN

 

La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología

 

MÉTODO QUÍMICO DE SECUENCIACIÓN

Desarrollado por Maxam y Gilbert en 1977.  Se basa en las propiedades químicas de las cuatro bases que componen el ADN que las hacen susceptibles a modificaciones específicas.  Consiste de los siguientes pasos:

1. Fragmentación:Antes de comenzar se debe preparar el ADN genómico para que este pueda ser secuenciado.  Esto consiste en fragmentar el ADN genómico, el método mas utilizado es mediante el corte enzimático utilizando enzimas de restricción, pero también puede emplearse cualquier otro método de fragmentación selectiva.

2. Marcaje del ADN.:Se puede realizar a partir de un ADN de cadena doble o sencilla, Este paso consiste en el marcaje de uno de los extremos de la cadena.  Para marcar el extremo 5’ radiactivamente con ³²ATP primero se debe quitar el fósforo presente en este extremo por medio de la hidrólisis utilizando la enzima fosfatasa alcalina y luego se adiciona el fosfato marcado transferido desde al ATP por medio de la enzima polinucleótido kinasa.

El extremo 3’ también puede ser marcado radiactivamente. Actualmente se han desarrollado fluorocromos para marcar ambos extremos y así facilitar la detección del marcaje.

3. Modificación de las Bases y fragmentación del ADN:Esta es la etapa más importante y fundamental de todo el procedimiento; en ella se busca generar fragmentos de ADN de cadena sencilla de tamaños variables, cuyo nucleótido final sea conocido.  Así, el tamaño de la hebra final indicará el orden de la secuencia, de acuerdo con el último nucleótido.

La reacción debe ser llevada a cabo en cuatro tubos diferentes.  En cada tubo se adicionan compuestos químicos que modifican las bases específicamente (Dimetil sulfato, Formato de piperidina, Hidracina y Hidracina + Alcali)

El Dimetil Sulfato, metila el N⁷ de las Guaninas, debilitando el enlace entre los C⁸ y C⁹ para que sean susceptibles a la ruptura. El Formato de piperidina debilita el enlace glicosidico de las Adeninas y Guaninas protonando átomos de nitrógeno en los anillos de purina, lo cual conduce eventualmente a la depurinizacion. La Hidracina rompe el anillo pirimidico, el cual al recircularizarse queda en forma de pentosa (solo 5 enlaces y no 6).  En presencia de álcali y NaCl la hidracina solo actúa sobre las Citosinas.  El álcali en presencia de NaOH hace una ruptura selectiva de A>C. (Molecular cloning)

Luego para remover las bases modificadas se adiciona Piperidina, la cual en solución acuosa y a 90 ºC remueve las bases modificadas rompiendo el enlace azúcar-fosfato. (Molecular cloning)

Para fragmentar las cadenas se adiciona piperidina, la cual corta el ADN en el azúcar al cual le falta la base. (Molecular cloning)

Las reacciones químicas deben realizarse con un estricto control de tiempo, temperatura y concentraciones tanto de los compuestos químicos como de las moléculas de ADN. (Molecular cloning)

4. Separación de los fragmentos y análisis:Esta es la etapa final del procedimiento y consiste en establecer la secuencia de la cadena de ADN, utilizando la electroforesis en geles de poliacrilamida de alta resolución y una posterior detección autoradiográfica.  La secuencia final es resuelta por la migración de los fragmentos de ADN, según su tamaño, dependiendo de la base sobre la cual se haya generado el corte químico.

La lectura del gel se realiza de abajo hacia arriba, siendo el extremo inferior el correspondiente al extremo 5’.

MÉTODO ENZIMÁTICO DE SECUENCIACIÓN

 

El método predominante hoy en día para la secuenciación del ADN es la técnica enzimática, conocida como el secuenciamiento didesoxi o el método de Sanger. Se basa en la interrupción controlada de la síntesis in vitro de una hebra complementaria al ADN de interés.

Este método se basa en que la síntesis in vitro de ADN catalizada por la enzima DNA pol puede ser interrumpida controladamente por la adición al azar de un didesoxinucleótido (ddNTP).  Los didesoxinucleótidos son deoxinucleótidos que les falta un grupo hidroxilo en las posiciones 2' y 3' y por eso no se pueden unir a otros nucleótidos, por lo tanto no se puede continuar con la extensión de la cadena. Es decir, actúan como terminadores de la cadena.

Síntesis de la cadena complementaria de ADN

Para realizar la reacción de síntesis in vitro de necesita:

«  Cadena de ADN molde: Se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.

«  Primer para iniciar la síntesis: Se necesita un corto oligonucleótido complementario al extremo 3’ de la cadena.

«  DNA polimerasa (Fragmento Klenow)

«  Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.

«  Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación (pe. ddATP)

Preparación para la reacción de secuenciación:Típicamente, en un secuenciamiento manual, se realizan cuatro reacciones, una para cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos terminadores de la cadena. En adición, ya sea el primer, usado para empezar la reacción, o uno de los desoxinucleótidos normales, está marcado; esto puede ser mediante un átomo radioactivo. El  didesoxinucleótido está presente en una concentración aproximada de 200 veces menor que su nucleótido competitivo. Por lo tanto, se presenta una competencia entre deoxinucleótidos y dideoxinucleótidos (pe.  dA y ddA) para incorporarse en la cadena creciente.

Separación de los fragmentos:Para separar los fragmentos de longitud variable producidos en cada tubo, las muestras de cada tubo son separadas en cuatro pozos en una electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante.

Detección del marcaje:A los geles de poliacrilamida se les toma una autoradiografía y se hace la lectura de las bases de abajo hacia arriba.  Se debe tener en cuenta que la secuencia obtenida es la del ADN complementario al ADN de interés y por lo tanto se debe hacer la conversión.

AUTOMATIZACIÓN DE LA SECUENCIA

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el primer o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.  Actualmente, existen dos formas de realizarlo:

Secuenciación empleando primers fluorescentes

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.  Las sondas fluorescentes utilizadas son:

para A ---> JOE. Emisión: verde. Derivado de fluoresceína
para C ---> FAM. Emisión: azul. Derivado de fluoresceína
para G --> TAMRA. Emisión: amarillo. Derivado de rodamina
para T --> ROX. Emisión: rojo. Derivado de rodamina

Durante la electroforesis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a través de un láser de argón que excita las sondas fluorescentes, la señal de emisión de fluorescencia, una vez amplificada, es detectada a través de un filtro y asignada a la base correspondiente.

Secuenciación empleando terminadores fluorescentes Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

Es el método mas utilizado actualmente

1.1.  SECUENCIADORES AUTOMATICOS

Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de poliacrilamida

La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de poliacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre un cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático para proceder a la carga de la muestras.  El secuenciador utilizado en este tipo de secuenciación es un ABI PRISM 377

El secuenciador automático ABI Prism 377 es un sistema de electroforesis y detección de fluorescencia controlado por microprocesador que se utiliza para secuenciación automática o análisis de fragmentos empleando el método de secuenciación automática en geles desnaturalizantes.

Durante la electroforesis las muestras pasan por delante de un haz de luz UV procedente de un láser de argón. La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN, correspondiente a la emisión de fluorescencia del nucleótido incorporado en 3´ (para secuenciación automática empleando terminadores fluorescentes), es recogida por una cámara CCD, encargándose el software del equipo de asignar a la fluorescencia emitida la base correspondiente

Secuenciadores automáticos capilares

Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de poliacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb. El secuenciador utilizado en este tipo de secuenciación es un ABI PRISM 310

El ABI Prism 310 es un instrumento automatizado que analiza fragmentos de ADN con marcas fluorescentes usando la electroforesis capilar. Los tubos con las reacciones de secuenciación son puestos en una gradilla para 48 o 96 muestras. El ingreso al capilar de las muestras se realiza por inyección electrocinética, esto es un corto período de electroforesis donde el capilar y el cátodo se encuentran inmersos en la muestra. Posteriormente el extremo del capilar cercano al cátodo se sumerge en tampón y se aplica corriente para continuar la electroforesis.

Cuando los fragmentos de DNA alcanzan la ventana del capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de ondas particulares y registradas como señales digitales en el computador. Para el procesamiento de los datos se utiliza el software "Sequencing Analysis" que asigna las bases para cada intensidad de fluorescencia detectada.

OTROS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

 

• Microarreglos
• Pirosecuenciación
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El futuro de la secuenciación

• Secuenciación por hibridación
• Secuenciación a futro sin fragmentación del ADN